一．病毒RNA样品提取
Real-time RT-PCR实验的第一步是获得纯净的RNA样品，检测H1N1病毒的呼吸道样本包括支气管肺泡灌洗液、气管抽吸物、痰、鼻咽或口咽洗液或拭子。而在流行病爆发时，能够对大批样品进行快速而安全的提取非常重要。ThermoFisher公司的KingFisher系列自动化磁珠提取纯化仪器，联合Ambion等公司的病毒RNA磁珠提取试剂盒，可以用于从多种来源的样本中，如血清、血浆、口腔拭子和细胞培养液中，提取病毒RNA。该系统不需有机溶剂或RNA沉淀步骤，消除了基于滤膜的方法经常碰到的问题，如滤膜堵塞、大的洗脱体积和不稳定的产率。KingFisher可以让操作人员免去很多繁琐的手工操作，并且远离病毒及有毒试剂的危害。而结合后续的实时定量RT-PCR，可仪检测到低至10拷贝的病毒RNA，可极大提高H1N1亚型猪流感病毒检测的灵敏度。
此技术经过美国国家兽医服务实验室（NVSL）验证，是美国农业部认可的禽流感检测的分子生物学方法。目前，日本的国立传染病研究所刚刚购买了4台新推出的Kingfisher Flex，应用于流感病毒RNA的纯化。韩国的Catholic University 也刚刚采购了Kingfisher mL用于病毒RNA的应用。越南的Kingfisher安装在世卫组织（WHO）的实验室。中国农业部兽医诊断中心、哈兽研动物流感参考实验室、北京出入境检验检疫局 等单位，以及澳大利亚和新西兰的Kingfisher系统也主要应用于这方面的工作。
二．Real-time RT-PCR检测
Real-time RT-PCR是目前最快速最灵敏的病毒检测方法之一，也是《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中推荐使用的方法。Real-time RT-PCR检测猪流感的方案是用一组寡聚核苷酸引物和Taqman探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。因为实验材料是RNA，所以推荐使用一步法反转录荧光定量PCR试剂盒。
美国Bio-Rad作为全球分子生物学实验室设备领域的领先者，对于流行病致病菌和病毒的检测一直非常关注。美国CDC/WHO 关于猪流感检测的文献和操作方法中，使用了Bio-Rad的一步法荧光定量PCR试剂盒iScript One-Step RT-PCR Kit，及Bio-Rad的荧光定量PCR仪。
美国Bio-Rad的CFX96 实时定量PCR仪，能够为使用者提供可靠的温度控制特性、最先进的光学检测技术和功能强大的软件控制及数据分析能力，能够得到精确的定量结果，准确区分目标基因。为研究者提供最佳的实时定量PCR结果。
CFX96 Touch实时定量PCR仪的主要特点
n 结果可靠——光源和检测器采用一体化的光梭，长寿命的LED和光敏二极管整合在一起，确保实验结果可靠；
n 快速得到实验结果——光学系统出厂时即经过严格校正，
仪器即插即用，能够在数分钟内完成安装，开始实验
n 缩短实验运行时间——快速的升降温速度，
能够在30分钟内完成定量PCR 实验
n 快速优化实验条件——温度梯度功能能够在一次实验中既能找到最优化的实验条件
n 减少实验样品和试剂的消耗——10 μl反应体系即能得到稳定可靠的实验结果
n 根据实验需要选择数据采集方法——支持SYBR Green 快速扫描模式
n 随时随地分析实验结果——软件能自动通过电子邮件将实验结果作为附件发送
n 提高检测通道——一台电脑能够控制多大4台CFX96 Touch 实时定量PCR 仪
美国Bio-Rad的一步法荧光定量PCR试剂盒iScript One-Step RT-PCR Kit，融合了iScript反转录酶系统和iTaq热启动DNA聚合酶系统，非常适用于病毒的快速检测，是美国CDC2007年推荐的检测猪流感的标准Protocol中采用的试剂盒。
iScript One-Step RT-PCR Kit的主要特点：
n 可兼容所有杂交探针进行灵敏和特异性的RT-PCR
n 线形动态范围从100fg到100ug，使客户的实验设计
具备很大的灵活性，可靠检测低拷贝的目标序列。
n 整个试剂盒只有优化过的三管成分，操作简便。
流水线化的反应组装程序，有效减少实验操作和试剂分装步骤中引入交叉污染的几率。
n 独特的低起泡配方，减少加样过程中带来的气泡，使高通量和自动化实验中的组装步骤变简单。
n 经验证，可对样品中拷贝数接近的两个目标序列进行同时检测。
三．样品操作与保存
《甲型H1N1流感病毒实验室检测方法》中要求样品处理要在生物安全实验室完成。生物安全实验室需要配备相应的生物安全柜对实验室环境、操作人员及样品进行保护。美国热电 Thermo Fisher旗下的 A2/B2型生物安全柜是世界上最好的生物安全柜，在国际上享有很好的盛誉。美国热电的生物安全柜（包括部分棑和全棑）都，达到Class 2等级，工作区气流洁净度达100级。此外，同属Thermo Fisher旗下的Forma系列-80℃超低温冰箱能够为样品提供最好的保存环境与保护，Forma系列液氮罐更可以用于有生物危险性的样品的运输。